凍存管冷凍步驟:

　　1、用預熱的PBS溶液洗滌細胞，吸取溶液，含有胰蛋白酶和EDTA的溶液覆蓋細胞(薄薄的液層足夠，胰蛋白酶和EDTA的濃度需要根據(jù)細胞系確定)。

　　2、37℃孵育細胞3-5分鐘。

　　3、細胞從底部脫離之后，終止孵育，加入含有血清的培養(yǎng)基，用移液器輕輕地懸浮細胞。

　　4、離心細胞懸液(500xg,5分鐘)，用含有血清的培養(yǎng)基重新懸浮。

　　細胞計數(shù)

　　1、離心細胞懸液(500xg,5分鐘)，去除上清液，用適量體積的含有血清的培養(yǎng)基重新懸浮細胞。

　　2、以1:1體積比混合細胞和凍存液(60%培養(yǎng)基，20%胎牛血清，20%DMSO)，然后轉(zhuǎn)移到凍存管中。凍存的細胞密度為1-5×106個/毫升。

　　3、含有細胞的凍存管建議以?1K/min的速率降溫，可以將凍存管置于?70℃含有異丙醇的容器中。如果凍存管存儲其他樣品，可以直接放置在?20℃，?70℃或者液氮的氣相。為了確保樣品冷凍均勻，4mL和5mL的凍存管需要先置于在?20℃冰箱過夜，然后再轉(zhuǎn)移到?70℃或者液氮的氣相。

　　4、然后轉(zhuǎn)移凍存管到液氮罐。為了避免污染(如支原體)和安全考慮，請將凍存管置于液氮的氣相，切勿置于液相。

　　操作凍存管復蘇，全程使用安全防護設備，建議穿實驗服、戴棉質(zhì)手套且在安全的實驗臺上進行操作。條件允許情況下，請佩戴護目鏡或防護面罩。由于夏季室內(nèi)溫度會高于冬季，請格外小心。凍存細胞儲存過程中，凍存管的冷凍溫度須均勻。不均勻的受凍將會導致冰塞的產(chǎn)生，冰塞會抑制兩側(cè)的液體溫度傳遞進而產(chǎn)生危險的高壓力并導致凍存管受損。