BUNSEN本生帶您了解：怎樣分析ELISA試劑盒包被和封閉問(wèn)題

　　一、 Elisa試劑盒包被方式

　　將抗原或抗體固定在過(guò)程稱為包被(coating)。蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過(guò)物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體表面的疏水基團(tuán)間的作用。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、濃度等的影響。

　　大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團(tuán)，故更易吸附到固相載體表面。不易吸附的非蛋白質(zhì)抗原可用間接包被的抗原經(jīng)固相抗體的親和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因此含雜質(zhì)較多的抗原也可采用捕獲包被法。

　　親和素生物素即用親和素先包被載體，加入生物素化的DNA，ELISA試劑盒這種包被方法均勻、牢固，已擴(kuò)大應(yīng)用于各種抗原物質(zhì)的定量測(cè)定。脂類(lèi)物質(zhì)無(wú)法與固相載體結(jié)合，可將其在有機(jī)溶劑(例如乙醇)中溶解后加入ELISA板孔中，開(kāi)蓋置冰箱或冷風(fēng)吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面。

　　優(yōu)點(diǎn)：試驗(yàn)的特異性、敏感性均由此得以改善，重復(fù)性亦佳。抗原用量少，僅為直接包被的1/10乃至于/100。

　　二、包被用抗原

　　天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類(lèi)。合成多肽抗原是抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一個(gè)抗原決定簇，純度高，特異性也高，但由于分子量太小，往往難于直接吸附于固相上。借助于偶聯(lián)物與固相載體的吸附，間接地結(jié)合到固相載體表面。

　　三、包被用抗體

　　IgG對(duì)聚苯乙烯有強(qiáng)吸附力，其聯(lián)結(jié)發(fā)生在Fc段上，ELISA試劑盒抗體結(jié)合點(diǎn)暴露于外。取材于抗血清或含單克隆抗體的培養(yǎng)液.須除去雜抗體后才能用于ELISA，以保證試驗(yàn)的特異性。

　　腹水中單抗的濃度較高，特異性亦較強(qiáng)，因此不需要作吸收層析處理，直接包被。在某些情況下，用多種單抗混合包被，可取得更好的效果。

　　四 、包被的條件

　　pH9.6碳酸鹽緩沖液

　　pH7.2的磷酸鹽緩沖液

　　pH7-8的Tris-HCL緩沖液

　　加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置，37℃中保溫2小時(shí)。ELISA試劑盒包被濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過(guò)實(shí)驗(yàn)與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為10ng/ml-20ug/ml。

　　二、Elisa試劑盒封閉問(wèn)題

　　封閉是ELISA實(shí)驗(yàn)中的一個(gè)步驟，而封閉的重要性是在于實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ降模裉焐虾：氵h(yuǎn)和您一起重點(diǎn)來(lái)看這個(gè)問(wèn)題。

　　抗原或抗體包被時(shí)所用的濃度較低，吸收后固相載體表面尚有未被占據(jù)的空隙，封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥在ELISA其后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。

　　封閉劑：

　　1. zui常用的是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白。

　　2. 也有用10%的小牛血清或1%明膠作為封閉劑的。

　　3. 脫脂奶粉也是一種良好的封閉劑，其zui大的特點(diǎn)是價(jià)廉，可以高濃度使用(5%)。

　　4. 高質(zhì)量的速溶食用低脂奶粉即可直接當(dāng)作封閉劑使用，但由于奶粉的成份復(fù)雜，而且封閉后的載體不易長(zhǎng)期保存，因此在試劑盒的制備中較少應(yīng)用。

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