ELISA標準曲線樣品檢測關鍵注意事項

　　一、標準品處理與稀釋

　　溶解與分裝?

　　凍干標準品需按說明書要求精確復溶，冰上操作并靜置5-10分鐘，輕柔混勻后分裝保存于-20℃或-70℃，避免反復凍融?。

　　稀釋時使用硅化EP管減少蛋白吸附，梯度稀釋需充分混勻，避免槍頭刮劃孔底?。

　　稀釋方法?

　　推薦反向稀釋法(從高濃度向低濃度逐級稀釋)，確保梯度準確性?。

　　標準品工作液現配現用，避免長時間室溫放置導致降解?。

　　二、實驗操作規范

　　加樣與孵育?

　　使用多通道移液器或校準單通道移液器，確保加樣體積一致，避免孔間污染?。

　　孵育時覆蓋板蓋，保持37℃恒溫(溫差≤1℃)，避免邊緣效應?。

　　洗滌控制?

　　洗滌液注滿孔內但不溢出，手工洗板時甩板動作需迅速(旋轉120-150度)，避免交叉污染?。

　　洗板后拍干使用無塵濾紙，避免殘留液體或碎屑干擾結果?。

　　三、顯色與檢測

　　顯色反應?

　　顯色時間控制在15-30分鐘，標準品前4孔應呈現明顯藍色梯度，最大OD值≥1.2?。

　　終止反應后15分鐘內完成比色，避免顯色產物降解?。

　　儀器校準?

　　酶標儀預熱30分鐘，使用標準濾光片校準波長(如TMB底物選450nm)?。

　　雙波長檢測(如450nm/630nm)可減少背景干擾?。

　　四、數據驗證與異常處理

　　標準曲線有效性?

　　線性回歸R2≥0.99，低濃度區間需符合預期梯度?。

　　若曲線整體偏低(最大OD<1.2)，需檢查試劑活性或標準品溶解狀態?。

　　常見問題解決?

　　無信號?：排查試劑失效(如HRP酶污染)或操作遺漏(如漏加抗體)?。

　　高背景?：優化封閉條件(延長封閉時間或更換封閉劑)或增加洗滌次數?。

　　五、質量控制建議

　　每批次實驗設置復孔(CV%<15%)，邊緣孔棄用或單獨分析?。

　　定期校準移液器和酶標儀，避免設備誤差?。

　　注：僅供科研使用，以上資料供參考，如需具體產品說明請咨詢技術老師或品牌供應商。

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